Polymerase Chain Reaction (PCR)

Setelah DNA dari sampel diekstraksi. Tahapan selanjutnya yang dilakukan adalah PCR. Polymerase Chain Reaction atau yang biasa disingkat PCR adalah metode perbanyakan (replikasi/amplifikasi) fragmen DNA secara enzimatik di luar organisme yang melibatkan siklus duplikasi DNA target sehingga menghasilkan jutaan salinan fragmen DNA. Fungsi dari PCR ini adalah mengamplifikasi materi genetik DNA secara In Vitro, dengan tujuan menghasilkan salinan dari suatu fragmen DNA di luar organisme yang dilakukan di dalam mesin PCR.

Di BIONESIA, setelah sampel dilakukan ekstraksi dan disimpan di kulkas atau freezer, barulah boleh dilakukan PCR. Pada tahap PCR ini, pertama yang perlu dilakukan adalah menyiapkan form terlebih dahulu untuk mencatat apa saja reagen dan sampel yang diperlukan serta takaran reagen dan sampel yang digunakan.

Setelah kita mengisi form, selanjutnya yang perlu dilakukan adalah meyiapkan reagen dan sampel yang diperlukan dengan cara dikeluarkan dari kulkas atau freezer. Biasanya sampel yang disimpan dalam freezer itu membeku ketika dikeluarkan sehingga kita didiamkan dalam suhu ruang beberapa saat agar cairan dalam reagen dan sampel mencair. Adapun reagen yang diperlukan untuk memulai tahap PCR yaitu ddH2O, primer (forward dan reverse), dan readymix.

Selagi menunggu reagen mencair, kita perlu menyiapkan alat-alat seperti strip tube untuk PCR product, micro tube untuk mastermix (campuran dari ddH2O, primer, dan readymix), tray untuk tube, reagen, dan sampel yang digunakan, serta menulis ID pada strip tube. Reagen dan sampel yang sudah mencair kemudian divortex agar DNA hasil ekstraksi lebih tersebar merata di dalam tube saat dilakukan pipetting.

Setelah semua alat dan bahan disiapkan, barulah kita mencampurkan ddH2O, primer, dan juga readymix ke dalam micro tube untuk mastermix. Kemudian mastermix dimix dengan cara divortex dan dipindahkan ke strip tube yang sudah diberikan ID. Selanjutnya mastermix yang sudah ada di dalam strip tube ditambahkan sampel sesuai jumlah atau takaran yang ditentukan. PCR product (mastermix yang sudah ditambahkan sampel) kemudian disentrifuge agar tidak ada cairan yang menempel di dinding strip tube.

Selanjutnya, PCR product diletakkan di thermal cycler untuk memulai proses amplifikasi DNA. Pada proses ini, DNA yang masih double strand dipanaskan hingga suhu tertentu agar terpisah menjadi DNA single strand (denaturation). Kemudian suhu diturunkan hingga suhu tertentu agar primer dapat menempel dengan DNA yang telah menjadi single strand (annealing). Kemudian suhu dinaikkan lagi pada suhu tertentu agar DNA polymerase dapat bekerja dalam proses pemanjangan primer yang membentuk fragmen DNA (extention). Proses ini biasanya berlangsung secara siklus sehingga prosesnya berulang sampai DNA cukup untuk dilanjutkan ke tahapan elektroforesis.

Setelah proses dalam thermal cycler selesai, PCR product yang telah teramplifikasi disimpan di kulkas bagian atas agar menjaga kandungannya tetap stabil.